真空冷凍幹燥技術在外泌體方向的應用

　更新時間：2024-11-07　點擊量：393

外泌體是納米級的細胞外囊泡，主要調節細胞間通訊。它們在納米醫學中具有巨大的應用潛力。然而，其分離技術因為昂貴儀器和試劑受到限製。仿生納米技術為藥物、RNA幹擾（RNAi）、蛋白質遞送和無藥物療法提供強大的支架，極大地影響了生物醫學。在大流行期間，納米技術在世界範圍內mRNA疫苗和診斷試劑盒的開發中發揮了重要作用。然而，傳統納米材料在臨床的轉化因靶點識別能力差和成本高昂從而受到影響。在這方麵，外泌體可能是解決上述問題的一個不錯選擇。

外泌體是細胞外囊泡，大小範圍為30-200 nm，幾乎所有類型的細胞都會分泌。它們通過攜帶DNA、RNA、RNAi、蛋白質、病毒、脂質、小分子和可溶性因子等多種有效載荷參與細胞間通訊。這些物質以旁分泌方式從親本（供體）輸送到受體細胞。外泌體繼承了有效載荷傳遞能力，這使它們成為藥物輸送的理想載體，通過將所需的物質裝載在其內部或表麵。外泌體也可用作某些疾病的診斷標誌物，例如神經退行性疾病和癌症。外泌體還有穿越體內所有生理屏障的能力，以及與血腦屏障（BBB）相關的能力，這在改善腦部疾病或切除腦癌方麵存在重大意義。外泌體可以從所有體液中分離出來，包括血漿、尿液、腦脊液、羊水、胸腔積液、腹水、支氣管肺泡杠杆、細胞培養等，它們大量存在於所有體液中。基於外泌體的無細胞療法具有高濃度和易於進入細胞和器官的特點，在生物醫學中具有顯著的優勢。

有幾種有效的外泌體分離方法，包括原型超速離心（用於80%的細胞外研究）、通過聚乙二醇（PEG）的密度梯度試劑、尺寸排阻色譜（SEC）和免疫沉澱等。然而，這些方法有一定的局限性，即超速離心機或商業試劑盒的成本高。此外，分離的外泌體樣品的純度、大小和濃度及其功能取決於所采用的分離方法。

凍幹（真空冷凍幹燥）現在通常用於延長富集外泌體的儲存時間。目前，它在外泌體分離中的應用是比較新穎的。有趣的是，大多數外泌體儲存緩衝液都有一個維持其結構和功能的方法。例如，4%海藻糖或10% w/v山梨糖醇和蔗糖有利於富集外泌體顆粒的冷凍幹燥。同樣，理想的pH值為6.5-7.5，氨基酸、穀氨酸和1%FBS對外泌體的凍幹過程是有利的，以避免冷凍休克並保持外泌體顆粒的結構完整性。同樣，對於細胞培養基，Dulbecco改良的Eagle培養基（DMEM）富含葡萄糖，pH值為6.8-7.4，主要富含L型穀氨酸，並補充10%FBS。與凍幹的外泌體顆粒儲存培養基類似，也就是說細胞培養基可以保護外泌體。因此，基於凍幹的技術能夠通過冷凍幹燥老化的細胞培養基來分離外泌體。然而，中国X站安装仍然需要依靠傳統的外泌體分離技術進行洗滌。盡管SEC或超速離心可以在一定程度上達到這種效果，但沒有一種分離方法可以純化外泌體樣品免受蛋白質汙染。

外泌體分離技術的比較研究評估了用於外泌體純化的各種商業試劑盒的效率、純度和可重複性及其在血漿和血清樣品中的 miRNA 質量。發現血清適合外泌體的分離，並且具有更多種類的外泌體 miRNA。研究還發現，每種分離方法在純度、外泌體數量和種類含量方麵都存在一定的局限性。相比之下，血漿更有利於外泌體分離。對於所有類型的外泌體樣本，與商業試劑盒相比，即使是超速離心也受到產量較低的限製，但純度相對較高。研究表明，外泌體貨物的檢測和分離取決於所采用的分離程序。基於凍幹外泌體的分離方法因其簡單性和成本效益而是一種不錯的選擇。

外泌體掃描電子顯微照片，比例尺：200 nm

使用凍幹方法分離外泌體，並使用掃描電子顯微鏡（SEM）表征大小和形狀。此外，納米顆粒追蹤分析（NTA）用於準確揭示樣品中外泌體的濃度和大小。貼壁細胞係和懸浮細胞係的細胞外囊泡平均大小均約為140 nm，這與報道的外泌體大小（30-200 nm）相符。基於蛋白質的外泌體的平均濃度可滿足下遊應用。一般外泌體表麵的蛋白標記物被認為是其表征的標準。例如，CD9、CD63 和 CD81 是內體特異性四跨膜蛋白。CD9首先在從樹突狀細胞中分離的外泌體上被發現。TSG101和HSP70是轉運複合物所需的內體分選複合物（ESCRT）複合物的組成部分，在外泌體生成中起著重要作用。鈣聯蛋白（Calnexin）是一種內質網標誌物，主要被評估為外泌體的陰性對照，主要存在於相對較大的囊泡上，而CD63存在於較小的囊泡上。Western blot試驗證實，除鈣聯蛋白外，所有這些重要標記物都存在於分離的外泌體表麵。

外泌體在納米醫學中的應用有利於藥物遞送和診斷。研究人員通過用達沙替尼和普納替尼負載這些分離的外泌體來評估這些外泌體的藥物負載和釋放能力（達沙替尼和普納替尼被用作Ph+白血病的酪氨酸激酶抑製劑），觀察到外泌體可以有效地負載藥物並將藥物遞送至靶細胞。藥物釋放研究是通過在不同時間點收集樣本在體外進行的。在8 h時，藥物釋放最佳，而在12 h時觀察到下降。研究結果證實了這一點，因為K562是一種白血病細胞係，具有較低的pH值，這會觸發藥物從外泌體釋放。

實驗樣本：外泌體

實驗目的：去除所有水分，保持樣品美觀，方便保存及下一步試驗

實驗設備：

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